拉曼光譜儀應用醫療篇——
以 SERS 為基礎的方法進行癌症外泌體的篩檢與多重檢測
研究背景
外泌體是攜帶細胞重要資訊的小型囊泡，與細胞間溝通以及腫瘤微環境的調節密切相關。先前研究顯示，外泌體是重要的癌症生物標誌物，其檢測對癌症診斷至關重要。表面增強拉曼散射(SERS)是一種獨特的生物分子檢測方法，SERS光譜能提供高靈敏度、高穩定性的指紋資訊。研究原理
製備第一層矽殼(MB@SiO₂)與第二層金(MB@SiO₂@Au)包覆的磁珠(MB)作為捕獲基材，其表面以表面蛋白CD63適配體(aptamer)修飾。同時，製備帶有特定適配體修飾的金奈米顆粒(AuNP@aptamer)作為讀出訊號源。為實現多重偵測，以三種不同類型的拉曼報告子與對應適配體合成三種SERS探針。當將一種目標外泌體加入到捕獲底物和SERS探針之混合物時，只有具專一性的SERS探針能辨識目標外泌體，並與磁性底物形成三明治型aptas-免疫複合物。
在複合物被磁鐵沉澱後，量測上清液的SERS訊號。添加外泌體對應的SERS探針訊號降低，而其他非專一性探針的訊號維持不變。因此，SERS強度降低表示此方法中目標外泌體的存在。
圖1：基於SERS的外泌體檢測方法原理。
結果與討論
1. SERS 探針的表徵與捕獲底物
圖2：(a) MB、(b) MB@SiO₂、(c) MB@SiO₂@Au的TEM 影像。(d) probeSKBR3 與 DNTB在1326 cm⁻¹ 優勢波段的 SERS 光譜。(e) probeLNCaP與2NAT在1378 cm⁻¹ 優勢波段的 SERS 光譜。(f) probeT84與MMC在1170 cm⁻¹ 優勢波段的SERS 光譜。
2. 分別檢測三種外泌體
三種外泌體的檢出極限(LOD)不同。SKBR3外泌體的LOD約每微升(µL)32個外泌體/µL；
T84外泌體的LOD約每微升(µL)73個/µL；
LNCaP外泌體的LOD約每微升(µL)203個/µL。
圖 3：(a) 加入不同濃度SKBR3、(c) LNCaP、(e) T84外泌體後的上清SERS光譜(濃度以「每µL外泌體」表示)。 (b)、(a)中 1326 cm⁻¹ 波段強度變化。(d)、(c)中1378 cm⁻¹ 波段強度變化。(f)、(e)中1170 cm⁻¹ 波段強度變化。圖中為目標外泌體濃度與相應波段強度變化相關性的非線性擬合函數。
3. 使用 SERS 探針進行外泌體篩選
如圖4所示，當三種探針混合在一起時，SERS探針仍能辨識其目標外泌體，表示可同時檢測到大量不同類型的外泌體；此結果顯示基於SERS-based的方法極具癌症篩檢應用潛力。
圖4：將 (a) SKBR3、(c) LNCaP、(e)不同濃度的T84外泌體加入「捕獲底物和三種SERS 探針」的混合物，上清液的SERS光譜。1326、1378、1170 cm⁻¹ 波段強度變化的校準曲線分別如圖(b)、(d)和(f)所示。
4. 同時檢測多種外泌體
與對照探針之SERS強度相比(圖5h)，於探針與底物的混合物中加入一種外泌體，會使對應探針的強度降低(圖5a–c)。兩種外泌體的加入導致兩個對應探針強度的降低(圖 5d–f)。此外，當三種外泌體同時加入時，三種探針的SERS強度均下降(圖5)。由光譜可容易區分所加入外泌體的類型。實驗結果顯示，SERS強度降低可提示相應類型外泌體的存在。
圖5：將(a) LNCaP、(b) T84、(c) SKBR3、(d) SKBR3和T84、(e) SKBR3和LNCaP、(f) LNCaP和T84、(g) SKBR3、LNCaP和T84外泌體加入到捕獲底物和SERS探針的混合物中所得到上清液的 SERS 光譜。(h) 捕獲底物的上清與空白對照的SERS探針之 SERS光譜。
5. 真實血液樣本中的外泌體檢測
評估SERS-based的方法在真實血液樣本中檢測外泌體的可行性：收集三名分別患有乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌的患者血液樣本，並以一名健康者的血液作為對照。健康者血液的SERS光譜在1326、1378、1170 cm⁻¹ 三個主要波段中強度最高；顯示健康者血液中不含上述三種癌細胞來源的外泌體。相對地，乳腺癌患者血液的SERS光譜呈現 probeH2訊號強度減弱；表示存在乳腺癌外泌體。同理，結直腸癌患者血液的SERS光譜顯示probeT84強度減弱；前列腺癌患者血液的probeLNCaP SERS強度亦較弱；皆表示存在相應類型之外泌體。結果證明，此SERS方法在癌症篩檢中具潛在應用前景。
圖6：將不同癌症患者之血液樣本加入到「捕獲底物和SERS探針」混合物後的上清之 SERS光譜。
實驗結論
本研究提出一種SERS-based且可以同時檢測不同類型外泌體的方法。在單一外泌體檢測中，SKBR3、T84和LNCaP外泌體的LOD分別為32、73和203/µL。此方法可用於區分目標外泌體之種類，模擬癌症篩檢流程。更重要的是，我們以乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌患者的真實血液樣本驗證其實際應用。文獻來源
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產品簡介
MR系列顯微拉曼光譜儀由拉曼轉接模組、照明光源、顯微鏡等部分構成。操作簡單、採集速度快，可同時觀察樣品微觀結構與其拉曼光譜，快速協助使用者完成檢測與分析。已廣泛應用於生醫、光致發光、微塑膠、二維材料（石墨烯）等科研領域。
產品特點
- 正置平場無限遠顯微鏡，可依需求配置手動或自動 XY 掃描載物台。搭配 900 萬畫素以上 CCD 相機成像。
- 可依需求配置 532 nm、785 nm、1064 nm 三種激發波長，最多支援 3 個通道。
- 拉曼光譜儀分體式模組化設計，可快速拆裝與組合；每個通道均配置獨立高靈敏光纖拉曼探頭，可單獨使用。
- 抽拉式成像/拉曼探頭耦合，最大程度確保拉曼訊號靈敏度。
- 配置高通量透射光柵拉曼光譜儀；於 785 nm 與 532 nm 激發下，即使在低功率狀態亦可有效量測空氣中 N₂ 的拉曼光譜。
- 光纖探頭可插拔；透過三通道耦合模組與顯微鏡耦合時，可單獨搭配液體/固體樣品支架進行常規拉曼量測；亦可搭配 C276 哈氏合金浸入式探頭，對強酸、有機與生物發酵溶液進行線上拉曼量測。